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快速上手mRNA-LNP等脂质纳米颗粒包裹核酸,超全超详细的入门级实验指南!

 时间:2024-06-18 17:14:41来源: 责任编辑:

基于微流控混合芯片制备核酸脂质纳米颗粒(mRNA-LNP合成为例)实验操作指南及LNP合成质量检测、转染细胞实验方案.

目录

实验方案:微流控混合方式制备包裹mRNA的脂质纳米颗粒

 1. 配制复方脂质-乙醇溶液:

 2. 配制柠檬酸缓冲液

 3. 计算RNA浓度,配制 mRNA-柠檬酸缓冲液:

 4. 微流控混合(智能LNP合成仪S1的操作说明):

 5. 粒径和PDI的检测

 6. 产物的处理和保存

实验方案:使用Qubit测定LNP包封率及利用率

实验方案:使用酶标仪测定LNP包封率

实验方案:mRNA-LNP转染293T细胞

实验方案:微流控混合方式制备包裹mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP的制备)

实验目的:

参照 Moderna、BioNtech 和 Alnylam 的新冠疫苗配方,以SM102、ALC-0315、MC3为主要阳离子脂质制备包载 mRNA 的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。

实验原理:

ALC-0315、 MC3、和 SM102 是三种可用于人体的脂质。在酸性条件下,质子化形成阳离子脂质,能够通过静电作用和带负电的 mRNA 结合。脂质与溶有mRNA的水性溶液混合后析出,自组装形成载有 mRNA 的脂质纳米颗粒。本实验中采用微流控混合法,让脂质溶液与mRNA溶液在微混合器中充分、迅速、高度可重复地形成粒径均一可控的LNP。在制备过程中,脂质溶解于乙醇,核酸溶解于酸性缓冲液中,故制备得到的LNP初产物含有高浓度乙醇。因此后续还需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至中性缓冲液中,以备后续生物学实验及长期保存。

实验所需微流控设备及芯片:

设备:FluidicLab 智能LNP合成仪(型号:LNP-S1)(微流控LNP合成)

微混合芯片:FluidicLab LNP-B1

图片1.png

实验步骤:

1. 配制复方脂质-乙醇溶液

2. 配制柠檬酸缓冲液

3. 计算RNA浓度,配制 mRNA-柠檬酸缓冲液

4. 微流控混合(智能LNP合成仪S1的操作说明)

5. 粒径和PDI的检测(良好的LNP合成结果如图)

图片2.png

6. 产物的处理和保存

6.1.透析

6.2.超滤

实验步骤详细内容较长,可浏览器搜索FluidicLab前往官网查看完整实验方案。

附件:

LNP合成超滤与不同条件透析对比

图片3.png

实验条件:仪器:Fluidiclab-S1 ;芯片:Fluidiclab-B1

MC3配方:12 mM浓度;流速比(脂相:水相)= 1 : 3;前废液 0.2 mL; LNP空包无mRNA;

合成初始——初产物经柠檬酸缓冲液稀释5倍后检测;

超滤使用Millipore 15mL/30 kd 超滤离心管(外径50mL尺寸)[UFC903096]。

透析使用Thermo Scientific Slide-A-Lyzer 透析盒 (20K MWCO)[66003]。

超滤后浓缩则使用[66003]透析盒后再使用[UFC903096]进行浓缩。

实验步骤参照第一节:《实验方案:微流控混合方式制备包裹mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP的制备)》。

mRNA-LNP转染HEK-293T

图片4.png

FluidicLab 提供LNP的DLS检测,包封检测,细胞转染等方案,欢迎咨询。


 

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